Veinte preguntas y respuestas sobre los test diagnósticos del SRAS-CoV-2

Cuando todo el país está ya en fase 3 y algunas comunidades en la llamada “nueva normalidad”, sigue la confusión con los tests. Precisión, inmunidad, carga viral, persistencia, seroconversión, PCR, anticuerpos… Las pruebas diagnósticas acaparan la atención pública y clínica ante la pandemia.

Cuando la pandemia remite en Europa y con la incertidumbre de que vuelva o de que los asintomáticos que andan sueltos generen sintomáticos, los tests de diagnóstico se han convertido en una pieza clave para controlar los brotes y rebrotes y para ir evaluando la prevalencia del coronavirus en la población general y en los colectivos más esenciales o vulnerables.

A partir de las observaciones en miles de pacientes en todo el mundo, ahora sabemos que el período medio de incubación de la Covid-19 es de cinco días, y si hay síntomas, la duración de la enfermedad estará entre 10-14 días; si bien hay casos graves hospitalizados durante dos meses o más y otros persistentes con larga permanencia viral. El desprendimiento viral del tracto respiratorio suele comenzar tres días antes del inicio de los síntomas y disminuye una vez que el paciente se vuelve sintomático. La detección de anticuerpos específicos se inicia durante la primera semana de síntomas, muchos pacientes seroconvierten al final de la segunda semana y casi todos al final de la tercera semana. Se cree que la mayoría de asintomáticos también seroconvertirán, aunque faltan datos para confirmarlo.

Varios de los 15 genes del coronavirus SRAS-CoV-2 se han utilizado como cebadores/sonda para los diagnósticos de PCR (reacción en cadena de la polimerasa), como el de la envoltura, el de la nucleocápside, el del ARN polimerasa-dependiente, el de la proteína no estructural 10 y el de la proteína no estructural 14. En un análisis que publica este mes en Clinical Infectious Diseases, el equipo de Ferric C. Fang, de la Universidad de Washington en Seattle y de LabCorp Diagnostic, responde algunas de las dudas frecuentes sobre estas pruebas diagnósticas.

Muestras y precisión de la PCR

¿Qué precisión tienen las pruebas de RT-PCR? En general, tienen una alta sensibilidad analítica con un límite de detección estimado que varía de 100 a 1.000 copias, y muy alta especificidad.

¿Qué tipos de muestra son los más adecuados para la PCR? La muestra estándar es una torunda nasofaríngea (NF), algo incómoda para el paciente y que, por la tos que puede provocar, requiere equipo de protección para el sanitario. Hay alternativas más cómodas como los hisopos nasales, orofaríngeos y de saliva. La comparabilidad de estos tipos de muestras para una prueba cualitativa depende de la carga viral presente en el momento de la infección. Los hisopos orofaríngeos tienen menos sensibilidad que los nasofaríngeos y nasales. Algunos estudios han indicado que las muestras autorrecolectadas son comparables en sensibilidad a las recogidas por un sanitario, y pueden obviar la necesidad de usar EPI. Aunque el esputo y las muestras de lavado broncoalveolar pueden tener cargas virales más altas y, por lo tanto, proporcionar mayor sensibilidad que las de las vías respiratorias superiores, particularmente en las últimas etapas de la enfermedad, implican un mayor riesgo de generación de aerosoles o requieren un procedimiento invasivo, por lo que se obtienen más selectivamente.

¿Una muestra negativa ya descarta el virus? No. Aunque los test de PCR tienen una alta sensibilidad, algunos pacientes no tienen niveles elevados de virus detectable en el tracto respiratorio superior. Esto puede deberse a una técnica de muestreo subóptima, porque un paciente está incubando la infección o eliminando el virus, o porque la replicación del virus ocurre en otros sitios, como el tracto respiratorio inferior. De hecho, los estudios han mostrado que algunos pacientes con Covid-19 y características señales pulmonares en la TC tienen pruebas negativas de PCR del tracto respiratorio superior. Quizá por la distribución variable de la proteína del receptor viral ECA2 en el tracto respiratorio. Curiosamente, también se observó tropismo viral para el tracto respiratorio inferior durante la epidemia de gripe H1N1.

¿Vale la pena repetir una prueba después de que un paciente haya dado negativo? Puede ser útil en un paciente en quien la sospecha clínica es alta. En nuestra experiencia, el rendimiento de repetir el test de la misma fuente es bajo. Sin embargo, puede ser sustancial para ajustar la prevalencia.

¿Cuánto tiempo permanecen positivos los pacientes infectados? Por lo general, en Covid-19 leve se elimina el virus después de una semana desde el inicio de los síntomas, pero puede haber ARN viral detectable en vías respiratorias durante períodos más largos. Los más graves seguirán siendo positivos para PCR por más tiempo. El ARN del CoV-2 también se puede encontrar en muestras de heces durante semanas. La evidencia indica que las células epiteliales intestinales humanas replican bien el virus. De ahí la preocupación de que la transmisión fecal-oral del virus pueda contribuir a su propagación.

¿Una muestra positiva significa que un paciente es infeccioso? No necesariamente. Aunque el ARN viral se puede detectar durante la convalecencia, se cree que el virus cultivable representa un mejor correlato de infectividad. Sin embargo, el cultivo del SRAS-CoV-2 requiere una instalación BSL-3 de bioseguridad y no hay ensayos autorizados que usen cultivos virales en este momento, por lo que la monitorización clínica depende de la detección del ARN.

¿Qué significa que un paciente se vuelva positivo para PCR después de una prueba inicial negativa? El criterio para discontinuar el tratamiento se basa en dos pruebas de PCR negativas con al menos 24 horas de diferencia. Sin embargo, algunos tendrán PCR positiva después de dos muestras negativas. Esto puede reflejar fluctuaciones en la cantidad de desprendimiento del ARN viral durante la recuperación. Los casos que han vuelto a la positividad exhiben una baja carga viral. Actualmente hay poca evidencia de una verdadera recaída clínica y virológica, y el pronóstico para estos pacientes parece ser bueno.

¿Es útil la PCR cuantitativa (carga viral)? Existe cierta correlación entre la gravedad de la enfermedad y la carga viral en la presentación, como se infiere por el umbral del ciclo de PCR en tiempo real. Sin embargo, la estimación de la carga viral aislada tiene un valor pronóstico limitado e incluso las personas asintomáticas pueden tener altas cargas virales, que disminuyen con independencia del curso clínico.

¿La edad afecta la carga viral? Los pacientes mayores tienden a tener mayores cargas virales, y mayor riesgo de enfermedad grave o crítica.

¿Cómo deben interpretarse los resultados indeterminados o no concluyentes? Implican que solo se detectó uno de los dos objetivos de la PCR, por lo que se recomienda un test diferente para la confirmación. Dada la alta especificidad de los ensayos de PCR, la mayoría de los resultados no concluyentes serán finalmente confirmados como positivos. Los no concluyentes o indeterminados también podrían indicar que los controles internos fallaron y pueden indicar un problema técnico, como la presencia de una sustancia inhibidora de PCR en la muestra. Asimismo, diferentes laboratorios y pruebas pueden usar diferente terminología.

Serología y anticuerpos

Los coronavirus contienen cuatro proteínas estructurales: el pico de unión al receptor inmunodominante (S), la proteína de la nucleocápside (N), la proteína de la envoltura (E) y la proteína de la membrana (M). Las plataformas de diagnóstico utilizadas para la detección de anticuerpos específicos contra las proteínas del SRAS-CoV-2 incluyen pruebas de diagnóstico rápido (RDT) tales como ensayos de flujo lateral (LFA), de inmunoabsorción enzimática (ELISA), de neutralización e inmunoensayos quimioluminiscentes. Solo los test de neutralización pueden proporcionar información sobre la capacidad de los anticuerpos para inhibir el crecimiento viral.

¿Qué precisión tienen las pruebas serológicas? El rendimiento de varias pruebas serológicas es más variable que los ensayos de RT-PCR para SRAS-CoV-2. Esto es importante porque lo positivo o el valor predictivo negativo de una prueba depende no solo de su precisión intrínseca sino también de la prevalencia de la enfermedad en la población. Una prueba insensible tendrá poca capacidad para excluir la presencia de enfermedad cuando la prevalencia es alta, pero una prueba con baja especificidad tendrá una capacidad pobre para indicar la presencia de enfermedad cuando la prevalencia es baja. Cuando solo un pequeño porcentaje de la población tiene inmunidad al SRAS-CoV-2, como es el caso actualmente, un resultado positivo de una prueba serológica con baja especificidad será más probable representar un falso positivo.

¿Las pruebas serológicas para SRAS-CoV-2 tienen reacción cruzada con otros coronavirus? Hay cuatro tipos de coronavirus humanos que causan infecciones respiratorias estacionales de leves a moderadas: 229E, NL63, OC43 y HKU1. La reactividad cruzada con anticuerpos contra ellos es una preocupación teórica para una prueba serológica SRAS-CoV-2, pero para la mayoría de los tests evaluados hasta ahora no parece ser el caso. Para descartar reactividad cruzada, se debe probar un nuevo test contra un panel de muestras de suero que son anteriores a la aparición del SRAS-CoV-2, idealmente más de 500, para determinar con precisión la especificidad. La reactividad cruzada entre SRAS-CoV-1 o MERS-CoV y SARS-CoV-2 es más probable, pero debería ser una preocupación limitada.

¿Son útiles las pruebas serológicas para diagnosticar Covid-19 aguda? Aunque el uso principal de las pruebas serológicas es determinar la exposición previa al SRAS-CoV-2, la detección de anticuerpos específicos puede apoyar el diagnóstico de Covid-19 en un paciente con alta sospecha clínica, pero pruebas de PCR negativas.

¿Se desarrollan pronto los anticuerpos? IgM e IgG dirigidas contra SRAS-CoV-2 pueden aparecer de 3 a 6 días después del inicio de los síntomas. A las tres semanas, casi todos los pacientes han seroconvertido y los anticuerpos persisten durante al menos dos meses, con la IgG que muestra una mayor persistencia.

¿Cuánto duran las respuestas de anticuerpos? No se sabe. Las respuestas a otros coronavirus decaen después de algunos años, y se sospecha que la inmunidad al SRAS-CoV-2 será similar.

¿Una muestra negativa significa que un paciente no ha tenido Covid-19 o carece de inmunidad al SRAS-CoV-2? Se han observado respuestas de anticuerpos en casi todos los pacientes con Covid-19, aunque es posible que algunas infecciones muy leves o asintomáticas, o en pacientes inmunocomprometidos, puedan no producir seroconversión.

¿Una prueba de anticuerpos positiva significa que un paciente es inmune? Es probable que la detección de los anticuerpos específicos en un paciente con antecedentes de enfermedad similar a Covid-19 será indicativa de al menos cierto grado de inmunidad. Así se ha observado en animales. Sin embargo, no se ha definido un corte cuantitativo del título de anticuerpos relacionado con inmunidad protectora. Al igual que con otros virus, es posible que un título bajo de anticuerpos no proteja. Además, no se sabe si los anticuerpos neutralizantes son el mecanismo primario de la protección inmune. De hecho, se observan títulos de anticuerpos más altos en pacientes con enfermedad grave. A medida que los pacientes con Covid-19 leve se recuperan a pesar de bajos títulos de anticuerpos, y los pacientes con Covid-19 grave tienen enfermedad persistente a pesar del desarrollo de títulos altos de anticuerpos, es necesario estudiar si los anticuerpos neutralizantes son de hecho protectores; los beneficios terapéuticos del plasma de convaleciente podrían deberse a componentes distintos. El desarrollo de anticuerpos neutralizantes está además acompañado por respuestas de células T, que pueden contribuir a la protección.

¿Son útiles las serologías cuantitativas? Al no haber inmunidad adaptativa al SRAS-CoV-2, no se requieren títulos agudos y convalecientes para establecer el diagnóstico de Covid-19. Hasta que los límites específicos se identifiquen como un correlato de la inmunidad protectora, los resultados serológicos cualitativos son suficientes para proporcionar orientación clínica. Sin embargo, lecturas serológicas cuantitativas podrían ofrecer más información sobre el potencial de falsos positivos y falsos negativos.

Otras pruebas

¿Están disponibles las pruebas inmediatas, en el punto de atención? Los diagnósticos asequibles en el punto de atención (POC) para el SRAS-CoV-2 podrían facilitar las pruebas generalizadas y las estrategias de localización de contactos propuestas para la ola pospandémica. Sin embargo, su rendimiento y sensibilidad carecen de la garantía de calidad de un laboratorio. Los resultados negativos de estas pruebas deben confirmarse mediante un método más sensible en la mayoría de los casos. Otros tests instantáneos, como un sistema de detección de ácido nucleico basado en CRISPR, pueden utilizarse en el futuro si logran la sensibilidad adecuada.

¿Son útiles los biomarcadores? Una variedad de biomarcadores, incluido el recuento de linfocitos, neutrófilos, PCR, troponina T, dímero D, LDH, procalcitonina, IL-6 y ferritina, son predictivos de progresión de la enfermedad y mortalidad. Estas pruebas de laboratorio juegan un papel vital en la identificación de pacientes con riesgo de complicaciones y para guiar los tratamientos. José R. Zárate (DM)

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